薄膜過濾微生物測試法
一、培養(yǎng)皿的準備
1.配備與待測樣品數(shù)相同的無菌培養(yǎng)皿,另上一個作對照組(每種培養(yǎng)劑一個對照組),在每個培養(yǎng)皿上標上待測樣品的記號
2.用燒過的鑷子將無菌吸收墊從包裝袋中取出,放入每個培養(yǎng)皿中,每取一個吸收墊,鑷子需用火燒一次
3.打開培養(yǎng)皿蓋子到剛能加上約1.8m1的培養(yǎng)劑在吸收墊上,強烈建議使用裝有培養(yǎng)劑的小安瓿瓶、小瓶或小管,當處理大量樣品時,可使用無菌的吸管來分配培養(yǎng)劑
二、培養(yǎng)劑的種類:
總菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
酵母和霉菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
大腸桿菌數(shù) MF-Endo培養(yǎng)劑
糞便大腸桿菌數(shù) M-FC培養(yǎng)劑
4.應有足夠的培養(yǎng)劑加入每個培養(yǎng)皿,使過濾膜能適當?shù)卣掣街諌|。但過多的培養(yǎng)劑會引起菌落擴展重疊,常常得不到正確的計數(shù)結果。有需要時,建議調整推薦的培養(yǎng)劑數(shù),以便粘附和菌落生長。
三、過濾器支架的準備:
1.打開預先滅菌的過濾器支架或將過濾器座、漏斗和漏斗蓋在沸水中浸沒一分鐘作消毒。若沒有沸水,用95%酒精噴灑于漏斗和漏斗蓋,然后將其點燃,在火熄滅以后,讓過濾器冷卻至40℃以下,如果必須使用酒精,漏斗必須用耐火材料制造。
2.用水煮過或火焰滅菌鉗子,將無菌過濾器的底座部分安裝于過濾燒瓶或真空管道上。
3.用火燒過的鑷子放一張無菌薄膜在過濾器底座上,根據測試目的,使用特定的過濾膜:
總菌數(shù)/大腸桿菌數(shù):0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮過或火焰滅菌鉗子,將過濾器漏斗和漏斗蓋放置于底座上。如漏斗蓋帶有管口,則在管口處裝上過濾器,或予以封住。待過濾器的溫度低于40℃后才可加樣品。
5.重復以上步驟,直到所有樣品都完成過濾。
四、樣品的過濾和平板培養(yǎng)
1.無菌地將樣品直接倒入消毒和冷卻的過濾器漏斗中。蓋上過濾器漏斗的蓋子。若使用勺須將勺放在95%的酒精的燒杯中。
2.施加真空,使樣品通過薄膜。無菌地打開裝有無菌水的玻璃瓶,先用火燒螺紋處,然后倒入約20毫升無菌水于過濾漏斗內,進行沖洗。施加真空,使無菌水通過薄膜。在過濾完樣品或無菌水后,不要讓真空施加時間連續(xù)超過30秒以上。
3.用火焰滅菌鉗子從過濾器底座上取下薄膜。輕微提起裝有吸收墊和培養(yǎng)劑的培養(yǎng)皿的蓋子,并放下薄膜,直到鑷子相對側的薄膜邊靠到吸收墊邊為止。將薄膜貼在吸收墊上滾動,以排除氣泡。蓋上蓋子,在工作臺上輕輕拍打培養(yǎng)皿,以驅除薄膜下面的氣泡。
4.作為對照組,用無菌水代替樣品重復上述過濾和平板培養(yǎng)程序。每一種培養(yǎng)劑須制備個空白培養(yǎng)皿。
五、樣品培養(yǎng)
1.為了防止在過濾膜表面形成冷凝水,所有培養(yǎng)皿必須倒置于培養(yǎng)箱中。
2.在培養(yǎng)箱中放置一燒杯水,以維持適當?shù)臐穸取?/span>
3.在以下溫度下培養(yǎng)可以得到的結果:
總菌數(shù) 35℃
酵母菌和霉菌數(shù) 28℃
 
大腸桿菌數(shù) 35℃
注:只能使用一次性的培養(yǎng)皿,不能使用重復用的培養(yǎng)皿。
六、菌落數(shù)的計算
1.總菌數(shù) 
必須分別在培養(yǎng)24小時和72小時后計算菌數(shù)。點計所有菌落(不管類型),并記錄高數(shù)目
2.酵母菌和霉菌數(shù)
在培養(yǎng)48小時后,計點酵母菌和霉菌數(shù),并在此后每隔24小時再計點一次,直到過第五天,記錄高數(shù)目。
酵母菌通常為圓形的白色菌落。有時他們也帶有顏色。在一天至兩天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培養(yǎng)劑而變成藍色。
霉菌菌落會顯示不同顏色(包括白色、黃色、紅色、藍色和黑色),但從“絨毛狀"或“棉花狀"外觀很容易辨認這種菌落。通常霉菌菌落比細菌或酵母菌的菌落為大。
細菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示劑,而其顏色會變成藍色、綠色、藍綠色或褐色。再這種培養(yǎng)劑中,細菌菌落比一般酵母菌小。
3.大腸桿菌數(shù)
大腸桿菌菌落呈綠色或墨綠色,并有明顯的金屬光澤。在培養(yǎng)24小時后,只計算有“金屬光澤"的菌落。
一、培養(yǎng)皿的準備
1.配備與待測樣品數(shù)相同的無菌培養(yǎng)皿,另上一個作對照組(每種培養(yǎng)劑一個對照組),在每個培養(yǎng)皿上標上待測樣品的記號
2.用燒過的鑷子將無菌吸收墊從包裝袋中取出,放入每個培養(yǎng)皿中,每取一個吸收墊,鑷子需用火燒一次
3.打開培養(yǎng)皿蓋子到剛能加上約1.8m1的培養(yǎng)劑在吸收墊上,強烈建議使用裝有培養(yǎng)劑的小安瓿瓶、小瓶或小管,當處理大量樣品時,可使用無菌的吸管來分配培養(yǎng)劑
二、培養(yǎng)劑的種類:
總菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
酵母和霉菌數(shù) 橙血清培養(yǎng)劑
大腸桿菌數(shù) MF-Endo培養(yǎng)劑
糞便大腸桿菌數(shù) M-FC培養(yǎng)劑
4.應有足夠的培養(yǎng)劑加入每個培養(yǎng)皿,使過濾膜能適當?shù)卣掣街諌|。但過多的培養(yǎng)劑會引起菌落擴展重疊,常常得不到正確的計數(shù)結果。有需要時,建議調整推薦的培養(yǎng)劑數(shù),以便粘附和菌落生長。
三、過濾器支架的準備:
1.打開預先滅菌的過濾器支架或將過濾器座、漏斗和漏斗蓋在沸水中浸沒一分鐘作消毒。若沒有沸水,用95%酒精噴灑于漏斗和漏斗蓋,然后將其點燃,在火熄滅以后,讓過濾器冷卻至40℃以下,如果必須使用酒精,漏斗必須用耐火材料制造。
2.用水煮過或火焰滅菌鉗子,將無菌過濾器的底座部分安裝于過濾燒瓶或真空管道上。
3.用火燒過的鑷子放一張無菌薄膜在過濾器底座上,根據測試目的,使用特定的過濾膜:
總菌數(shù)/大腸桿菌數(shù):0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮過或火焰滅菌鉗子,將過濾器漏斗和漏斗蓋放置于底座上。如漏斗蓋帶有管口,則在管口處裝上過濾器,或予以封住。待過濾器的溫度低于40℃后才可加樣品。
5.重復以上步驟,直到所有樣品都完成過濾。
四、樣品的過濾和平板培養(yǎng)
1.無菌地將樣品直接倒入消毒和冷卻的過濾器漏斗中。蓋上過濾器漏斗的蓋子。若使用勺須將勺放在95%的酒精的燒杯中。
2.施加真空,使樣品通過薄膜。無菌地打開裝有無菌水的玻璃瓶,先用火燒螺紋處,然后倒入約20毫升無菌水于過濾漏斗內,進行沖洗。施加真空,使無菌水通過薄膜。在過濾完樣品或無菌水后,不要讓真空施加時間連續(xù)超過30秒以上。
3.用火焰滅菌鉗子從過濾器底座上取下薄膜。輕微提起裝有吸收墊和培養(yǎng)劑的培養(yǎng)皿的蓋子,并放下薄膜,直到鑷子相對側的薄膜邊靠到吸收墊邊為止。將薄膜貼在吸收墊上滾動,以排除氣泡。蓋上蓋子,在工作臺上輕輕拍打培養(yǎng)皿,以驅除薄膜下面的氣泡。
4.作為對照組,用無菌水代替樣品重復上述過濾和平板培養(yǎng)程序。每一種培養(yǎng)劑須制備個空白培養(yǎng)皿。
五、樣品培養(yǎng)
1.為了防止在過濾膜表面形成冷凝水,所有培養(yǎng)皿必須倒置于培養(yǎng)箱中。
2.在培養(yǎng)箱中放置一燒杯水,以維持適當?shù)臐穸取?/span>
3.在以下溫度下培養(yǎng)可以得到的結果:
總菌數(shù) 35℃
酵母菌和霉菌數(shù) 28℃
 
大腸桿菌數(shù) 35℃
注:只能使用一次性的培養(yǎng)皿,不能使用重復用的培養(yǎng)皿。
六、菌落數(shù)的計算
1.總菌數(shù) 
必須分別在培養(yǎng)24小時和72小時后計算菌數(shù)。點計所有菌落(不管類型),并記錄高數(shù)目
2.酵母菌和霉菌數(shù)
在培養(yǎng)48小時后,計點酵母菌和霉菌數(shù),并在此后每隔24小時再計點一次,直到過第五天,記錄高數(shù)目。
酵母菌通常為圓形的白色菌落。有時他們也帶有顏色。在一天至兩天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培養(yǎng)劑而變成藍色。
霉菌菌落會顯示不同顏色(包括白色、黃色、紅色、藍色和黑色),但從“絨毛狀"或“棉花狀"外觀很容易辨認這種菌落。通常霉菌菌落比細菌或酵母菌的菌落為大。
細菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示劑,而其顏色會變成藍色、綠色、藍綠色或褐色。再這種培養(yǎng)劑中,細菌菌落比一般酵母菌小。
3.大腸桿菌數(shù)
大腸桿菌菌落呈綠色或墨綠色,并有明顯的金屬光澤。在培養(yǎng)24小時后,只計算有“金屬光澤"的菌落。